ÖNEMLİ..!!

Değerli Müşterimiz,

 *Numune hazırlama ve uyumlu örnek türleri ile ilgili ürüne özel ayrıntılar için lütfen kitinizle birlikte verilen protokole MUTLAKA  bakınız…!!! 

*Her zaman  her ihtimale karşı MUTLAKA örneklerinizi çift veya üçlü olarak  fazladan almanızı KESİNLİKLE tavsiye ediyoruz.  

*Bu  protokoller ve prospektüsler  bir b,lgilendirme kaynağı olarak düşünülmüştür. Bunlar, yaygın olarak test edilen örneklerin ELISA analizlerinde kullanılması için hazırlanması için genel kurallardır.

*Tahlil gelişiminin tüm yönleriyle olduğu gibi, optimum numune hazırlama prosedürleri, hedefin ve ilgilenilen tahlilin türüne göre değişiklik gösterecektir.

*Çözülmeye bırakılan numuneler tekrardan dondurulmamalıdır.

*Kan alma Tüpleri ve  serum aktarma  eppendorf tüplerinin kaliteli olması gerekmektedir.

Eppendorf  Tüpü:

*Serumlarınızın bekleme süresini kit çalışmanızla doğru orantılı dondurmalısınız.. Detaylı Bilgi için bizim ile iletişime geçebilirisiniz. 

*Yeni bir deney hazırlarken kendi deneysel örnekleri için literatüre başvurmak daima iyi bir uygulama olup projeleriniz bizim için çok önem kazamaktadır. Aşağıdaki bilgilere dayalı ve kanıtlanmış makale ve yayınlardan faydalanarak hazırlanmıştır. (*server ve siber saldırılardan dolayı yazı ve karekterin bozulmuş olması, cümle ve anlamsız bilgiler hariç) Takıldığınız konuda  mutlaka bizimle iletişime geçebilirisiniz. İletişim için Tıklayınız…

 

NUMUNE HAZIRLAMA YÖNTEMLERİ:

Örnek Elisa Kitin Türkçe Kullanım Prospektüsü için Tıklayınız.    İnsan BPA Eliza Kit 96 Test  PDF

HÜCRE KÜLTÜR SÜPERNATANI

  1. Hücre kültürü ortamını bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve 1500 rpm’de 10 dakika süreyle 4 ° C’de santrifüjleyin.
  2. Hemen süpernatantı alın ve örnekleri -80 ° C’de saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

HÜCRE ÖZÜ

  1. Doku kültürü plakalarını buz üzerine yerleştirin.
  2. Ortamı aspire edin ve buzlu soğuk PBS ile hücreleri bir kez hafifçe yıkayın.
  3. PBS’yi aspire edin ve 100 mm’lik plaka başına 0.5 ml komple ekstraksiyon tamponu ekleyin.
  4. Hücreleri, eğik plakalarda toplamak için kazıyın ve önceden soğutulmuş boruya alın.
  5. Kısa süreli vorteksleyin ve buz üzerinde 15-30 dakika inkübe edin.
  6. Çözünmeyen içeriği pelet haline getirmek için 13,000 x rpm’de 10 dakika boyunca 4 ° C’de santrifüjleyin.
  7. Buz üzerinde soğutulmuş tüplerin temizlenmesi ve -80 ° C’de numunelerin depolanması için alikotik süpernatant (çözünür hücre özütüdür). dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

ŞARTLI ORTAM

  1. Hücreleri komple (serum içeren) büyüme ortamı içine yerleştirin ve hücrelerin istenilen seviyeye çoğalmasına izin verin.
  2. Büyüme ortamını çıkarın ve birkaç ml sıcak PBS ile hafifçe yıkayın. Yıkama adımını tekrar edin.
  3. Son PBS yıkamayı çıkartın ve serum serbest büyüme maddesi ekleyin.
  4. 1-2 gün inkübe edin.
  5. Ortamı bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve 5 dakika süreyle 10 dakika boyunca 4 ° C’de santrifüjleyin.
  6. Hemen süpernatanı alın ve örnekleri -80 ° C’de saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

SÜT

  1. Numuneleri toplamak ve 10,000 x g’de 2 dakika süreyle 4 ° C’de santrifüj uygulayın.
  2. -80 ° C’de alındıklarında süpernatantı alın ve örnekleri saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

 PLAZMA

  1. Tam kanı, pıhtılaşma önleyici olmayan tüpe, örneğin kalitesiz tüp kullanmamalısınız. (BD tavsiye ediyoruz. )Vacutainer Koagülasyon tüplerine (Cat #: 363080/363080) veya 0.1 M sodyum sitratın 1/10 son hacme ilave edin.
  2. 10 dakika boyunca 4 ° C’de 3.000 devirde santrifüjleyin.
  3. Hemen süpernatant (plazma) alikotu ve numuneleri -80 ° C’de saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

BD Tüpleri İncelemek için Tıklayınız. http://www.bd.com/tr-tr/offerings/blood-and-urine-collection

 İDRAR

  1. Numuneleri toplamak ve 10,000 x g’de 2 dakika süreyle 4 ° C’de santrifüj uygulayın.
  2. -80 ° C’de alındıklarında süpernatantı alın ve örnekleri saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

TÜKÜRÜK

  1. Numuneleri toplamak ve 10,000 x g’de 2 dakika süreyle 4 ° C’de santrifüj uygulayın. 1- -80 ° C’de alındıklarında süpernatantı alın ve örnekleri saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

SERUM

  1. Tam kan test edilmemiş test tüpü içine veya örneğin BD gibi anti-koagülansız bir tüpte toplanmalıdır.İlgili resim

Vacutainer Serum tüpleri (Kat # 367812).

  1. Oda sıcaklığında 20 dakika  inkübasyon yapılmalı
  2. 10 dakika boyunca 4 ° C’de 3.000 devirde santrifüjleyin.
  3. Hemen süpernatant (serum) alikotu ve numuneleri -80 ° C’de saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

DOKU 

  1. İlgilenen dokuyu temiz araçlarla, tercihen ve mümkün olduğunca çabukça buz üzerinde engellemek için

proteazlar tarafından bozunum.

  1. Doku yuvarlak dipli mikrofüj tüplerine yerleştirin ve sıvı nitrojene daldırın “hızlı dondurma” yapın. mağaza

Daha sonra kullanmak için -80 ° C’de numuneler veya derhal homojenizasyon için buzda tutun.

  1. Yaklaşık 5 mg’lık bir parça için ~ 300 ul tam ekstraksiyon tamponu ekleyin (bkz. Hücre / doku ekstraksiyon tamponu reçetesi)

tüpün üzerine yerleştirin ve bir elektrikli homojenleştirici ile homojenize edin.

  1. Her durulama için 300 μl komple ekstraksiyon tamponu kullanarak bıçağı iki kez durulayın, daha sonra sabit tutun

4 ° C’de 2 saat çalkalama (örn. soğuk odada bir orbital çalkalayıcıya yerleştirme).

  1. 20 dakika süreyle 13,000 x rpm’de 4 ° C’de santrifüjleyin. Buz üzerine yerleştirin, alikot süpernatant (çözünür protein

Özü) taze, soğutulmuş bir tüpe koyun ve örnekleri -80 ° C’de saklayın. Dondurma / eritme döngülerini en aza indirin.

 

DİĞER NUMUNME ÇALIŞMALARI İÇİN( Rahim sıvısı, Vajina Sıvısı ve diğer tüm sıvılar)  bizim ile iletişime geçebilirisiniz. İletişim için Tıklayınız: 

DİŞ SIVISI

DIŞKI

BALGAM

BOĞAZ SALGISI

BOSS

RAHİM SIVISI

VAJİNA SIVISI

 

1-) ELİZA KİTİ  NEDİR? Enzim bağlantılı immünosorbent assay (ELİZA KİT) bir enzim immunoassay ELİZA KİT (EIA) olarak da bilinen enzim bağlı immunosorbent assay (ELİZA KİT) bir numunede bir antikorun veya bir antijenin varlığını saptamak için başta immünolojide kullanılan biyokimyasal bir tekniktir. ELİZA KİT gıda endüstrisinde ELİZA KİT uygulaması gibi çeşitli endüstrilerde tıp ve bitki patolojisinde bir tanı yöntemi olarak kullanılmaktadır . Basitçe, ELISA’da, bilinmeyen bir miktarda antijen bir yüzeye yapıştırılır ve daha sonra, antijenle bağlanabilmek için yüzey üzerinde spesifik bir antikor uygulanır. Bu antikor, bir enzime bağlıdır ve son adımda, enzim, bir kimyasal substratta renk değişikliği olmak üzere, saptanabilir bir sinyal haline dönüşebilen bir madde eklenir. Örnek prospektüs incelemek için Tıklayınız… (Human Cytokeratin 18-M30(CK 18-M30) ELISA kit )

ELİZA KİTİNİ  testi ile neyi amaçlıyoruz?

Birden fazla epitopa sahip bir protein algılanıyorsa, sandviç testi iyi bir seçimdir. Genellikle farklı epitoplarla reaksiyona giren iki antikor gerektirir. Bununla birlikte, molekül çoklu tekrar eden epitoplara sahipse, bir sandviç testinde hem yakalama hem de saptama için aynı antikoru kullanmak mümkündür.

Alternatif olarak, analitin saf haldeki mikrodalgaya etkin bir şekilde emebilen bir kaynağı varsa, saflaştırılmış analitin hareketsizleştirildiği ve numunedeki analitin sabitleştirilen analitle rekabet ettiği rekabetçi bir deney hazırlayabilir Etiketli antikora bağlanır. Bu durumda, antikorun sınırlandırılması için titrasyon yapması veya test duyarlılığının düşürülmesi esastır.
Polistiren, kaplama çözeltisindeki konsantrasyonlarına bağlı olarak artan bir miktarda çok çeşitli protein bağlayacaktır. Spesifik ve optimum miktar, her protein için belirlenmelidir, ancak antikorlar için bazı genel gözlemler yapılmıştır. IgG -cm 200 ng – düşük bağlanma plakalara orta tipik olarak 100 kadar bağlanan 2 , IgG / cm 500 ng – yüksek bağlanma plakalar tipik olarak 400 bağlanabildiği ise 2. Proteinlere ek olarak, polistiren plakalar genellikle 15-20 amino asit uzunluğunda peptitleri emecektir. Güçlü bağlanmayı elde etmek için, bir peptid hem hidrofob hem de hidrofilik etkileşime ihtiyaç duyacaktır. Tipik olarak, peptidleri doğrudan adsorbe etmekteki bir sakınca, az sayıda epitopa sahip olma eğiliminde olmaları ve bunlar plastik ile etkileşimde bulunmaları durumunda, bir antikorun kendilerine bağlanmasının zor olacağıdır. Bir alternatif peptidi, peptit ve protein arasında bir miktar mesafe sağlayan antikorun peptid ile etkileşime girmesine izin veren bir ayırıcı kol vasıtasıyla daha büyük bir proteine bağlamaktır.
Tüm organizmaları tespit eden bakteriyel veya viral analizler gibi bir organizma, hem yakalama hem de algılama için aynı antikor ile sandviç deneyleri de kullanabilir. Hedef molekül küçükse ya da tek bir epitoptan oluşuyorsa, yukarıda tarif edilen biçimlerin bir modifikasyonu gereklidir. Küçük moleküller, tek başına bir katı faza iyi adsorbe olmazlar veya bloke protein eklenerek maskelenebilirler. Bununla birlikte, küçük moleküller çoğunlukla, epitopun bir antikor ile bağlanmasına izin veren bir konfigürasyonda istenen epitopu bir katı faza bağlamak için bir vasıta sağlayan daha büyük proteinlere bağlanabilir.
Karbohidratlar ve ağır glikosillenmiş proteinler, hidrofobik etkileşimlere katılma yetenekleri çok az olduğu için, yukarıda açıklanan kuvvetlerle polistirene iyi adsorbe olmazlar. Hücrelerden salınan ve deterjanla çözelti içerisinde muhafaza edilen zar proteinleri deterjan varlığında iyi adsorbe edilmezler. Kovalent bağlantı veya deterjan konsantrasyonunun azaltılması, bu proteinlerin eklenmesi için en iyi araçtır.

Bir ELİZA KİT gerçekleştirmek, belirli bir antijen için spesifikliğe sahip en az bir antikor içerir. Bilinmeyen miktarda antijene sahip numune, ya spesifik olmayan olarak (yüzeye adsorbe yoluyla) ya da spesifik olarak (başka bir antikor ile yakalanarak) bir katı desteğe (genellikle bir polistiren mikro-titre plakası ELİZA KİT cihazının bölümünde ayrıntılı olarak görülebilir ) “sandviç” ELİZA KİT de aynı antijene spesifik )

Antijen hareketsiz hale getirildikten sonra, tespit antikoru eklenerek antijen ile bir kompleks oluşturur. Tespit antikoru, bir enzime kovalent olarak bağlanabilir veya biyokonjüjasyon yoluyla bir enzime bağlı ikincil bir antikor ile tespit edilebilir. ELİZA KİT antikor inkubasyonunun kısmı, western blot’la benzerdir.

Her adιm arasιnda plaka, tipik olarak bağlanmamιş olan herhangi bir proteini veya antikoru çιkarmak için tipik olarak hafif bir deterjan solüsyonu ile yıkanιr. Nihai yıkama adımından sonra, numune içindeki antijen miktarını belirten görünür bir sinyal üretmek için enzimatik bir alt tabaka ilave ederek plaka geliştirilir.

Direkt Eliza Kit ne demek?

Öncelikle Doğrudan ELİZA Basit ve Zamandan Tasarruf yapılarak yapılan yöntemdir.

Başlangıçta ELİZA’nın en basit türü olduğu düşünülen direkt bir ELİZA testinde antijen bir plastik plaka üzerine adsorbe edilir ve sonra diğer tüm bağlanma bölgelerini bloke etmek için bir başka proteinin fazlalığı (normal olarak sığır serumu albumin) ilave edilir. Bir enzim, ayrı bir reaksiyonda bir antikora bağlanırken, enzim-antikor kompleksi, antijeni adsorbe etmek için uygulanır. Aşırı enzim-antikor kompleksi yıkandıktan sonra, antijene bağlanan enzim antikoru bırakılır. Enzim substratına eklenerek enzim, antijenin sinyalini gösteren bir şekilde tespit edilir.

 

İndirekt Eliza ne demek?

1- ELİZA KİTİ birincil antikor ve etiketli sekonder antikorun iki bağlanma sürecini içeren iki aşamalı ELİZA’dır. Primer antikor , ikincil antikor ile kuluçka takip antijen ile inkübe edilir. Bununla birlikte, bu ikincil antikorun ortaya çıkabileceği çapraz reaksiyon nedeniyle spesifik olmayan sinyallere neden olabilir.

Mikro kuyucuklu plakalar antijenler ile inkübe edilir, yıkanır ve BSA ile bloke edilir.

2- Antikor içeren numuneler eklenir ve yıkanır.

3-  Enzim bağlı sekonder antikor eklenir ve yıkanır.

4- Bir substrat ilave edilir ve antikor üzerindeki enzimler, bir kromojenik veya floresan sinyali ortaya çıkarır.

 

Yüksek duyarlılık: Birden fazla etiketli antikor, antijen molekülü başına bağlanır;

Esnek: Farklı primer tespit antikorları tek bir etiketli sekonder antikor ile kullanılabilir;

Maliyet tasarrufu: Daha az sayıda etiketli antikor gereklidir.

İndirekt ELİZA testinde numune antikoru, plakada kaplanan antijen ile bir enzim etiketli anti-tür globulin konjügatı arasında sandviç haline getirilir. Bir enzim substrat-kromojen reaktifinin ilavesi, rengin gelişmesine neden olur. Bu renk, bağlı örnek antikorunun miktarı ile doğru orantılıdır. Numunede bulunan antikor ne kadar fazla olursa, test kuyularında renk gelişimi o kadar güçlüdür. Dolaylı ELİZA’nın bu biçimi, numunelerdeki toplam antikor düzeyini ( Newcastle hastalığı virüsü , B. abortus, vb.) Belirlemek için uygundur . Antikor titrasyonunun belirlenmesinde dolaylı ELİZA uygulaması ve antikor konsantrasyonunun belirlenmesi prosedürleri hakkında ayrıntılı bilgi , ELİZA başvurularının aşağıdaki bölümünde tartışılmıştır.

kaynak: Sino Biologinocal inc.

 

2-) SANDVİÇ  ELISA KİTİ NEDİR?

Bir sandviç  ELISA, iki antikor tabakası arasındaki antijeni ölçmektedir (yakalama ve tespit antikoru). Hedef antijen, antikora bağlanabilen en az iki antijenik bölge içermelidir.

Monoklonal veya poliklonal antikorlar sandviç ELISA sistemlerinde yakalama ve tespit antikorları olarak kullanılabilir. Monoklonal antikorlar, antijendeki küçük farklılıkların nicelleştirilmesini sağlayan tek bir epitopu tanımaktadır. Bir poliklonal, mümkün olduğu kadar antijenin çoğunu indirmek için yakalama antikoru olarak sıklıkla kullanılır.

Sandviç ELISA analizden önce numune saflaştırma aşamasını kaldırır ve hassasiyeti arttırır (doğrudan veya dolaylıdan 2-5 kat daha hassas).

GENEL NOTLAR:

Sandviç ELISA prosedürleri optimize etmek zor olabilir ve test eşleşmiş antikorlar kullanılmalıdır. Bu, antikorların hedef proteindeki farklı epitopları bulgulamasını sağlar ve diğer antikor bağlanmasına müdahale etmez. Özellikle test edilmedikçe, antikorlarımızı sandviç  ELISA’da garanti etmek mümkün değildir.

Test edilmiş uygulama bilgileri için antikor PROSPEKTÜSLERİ mutlaka gözden geçirin.

Yakalama antikoru ile kaplama

  1. PVC mikro-titre plakasının kuyularını yakalama antikoru ile 1-10 μg / mL konsantrasyonda karbonat / bikarbonat tamponu (pH 9.6) ile kaplayın.
    Saflaştırılmamış antikorlar (örn., Asit sıvısı veya antiserum) spesifik antikorun daha düşük konsantrasyonunu telafi etmek için numune proteininin konsantrasyonunu artırmak (10 μg / mL’yi deneyin) gerektirebilir.
  2. Plakayı yapışkan plastik ile örtün ve gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin.
  3. Kaplama çözeltisini çıkarın ve oyukları 200 μL PBS ile doldurarak plakayı iki kez yıkayın. Çözeltiler veya yıkamalar plakayı bir lavaboya çarparak kaldırılır. Kalan damla bir kağıt havlu üzerine plakayı bastırılarak çıkartılır.

Bloklama ve numuneler ekleme

  1. Kuyu başına 200 μL bloke edici tampon (% 5 yağsız kuru süt / PBS) ilave ederek kaplı kuyularda kalan protein bağlama yerlerini bloke edin.
  2. Plakayı yapışkan plastik ile örtün ve en az 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin.
  3. Plakayı iki kez 200 μL PBS ile yıkayın.
  4. Her göze 100 uL seyreltilmiş numuneler ekleyin. Bilinmeyen örneklerin sinyallerini standart eğri ile karşılaştırınız. Standartları çalıştırın (çiftler veya üçlüler) ve her plaka ile birlikte boşaltın. 37 ° C’de 90 dakika inkübe edin.Standartların yoğunlaşmasının, antikor bağlanmanın en dinamik tespit yelpazesini kapsadığından emin olun. Uygun bir standart eğri elde etmek için konsantrasyon aralığını optimize etmeniz gerekebilir. Her zaman örnekleri ve standartları çift veya üçlü olarak çalıştırın.
  5. Numuneleri çıkarın ve plakayı 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.

Saptama 

  1. Her göze 100 uL seyreltilmiş tespit antikoru ekleyin.
    Tespit antikorunun yakalama antikoruna hedef protein üzerindeki farklı bir epitopu tanıdığını kontrol edin. Bu, antikor bağlanması ile karışmayı önler. Mümkün olduğunca test edilmiş eşleştirilmiş bir çifti kullanın.
  2. Plakayı yapışkan plastik ile örtün ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  3. Plakayı dört kez PBS ile yıkayın.
  4. Kullanımdan hemen önce blokaj tamponunda seyreltilmiş 100 uL konjuge sekonder antikor ekleyin.
  5. Plakayı yapışkan plastik ile örtün ve 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  6. Plakayı dört kez PBS ile yıkayın.

BULMA YÖNTEMİ

AT turp peroksidaz (HRP) ve alkalin fosfataz (ALP), ELISA tahlillerinde tespit için en çok kullanılan iki enzimdir.

Bazı biyolojik materyallerin, yüksek oranda endojen enzim aktivitesine (alveoler hücrelerde yüksek ALP, alyuvar hücrelerinde yüksek peroksidaz gibi) sahip olduğunu ve bu da spesifik olmayan sinyalle sonuçlanabileceğini düşünün. Gerekirse, levamisol (ALP için) veya metanolde% 0.3 H202 (peroksidaz için) ile ilave bir bloke etme işlemi uygulayın.

ALP substrat

P-Nitrofenil-fosfat (pNPP) çoğu uygulama için en yaygın kullanılan substrattır. Oda sıcaklığında 15-30 dakika inkübasyondan sonra 405 nm’de nitrofenolün sarı rengini ölçün ve eşit miktarda 0.75 M NaOH ekleyerek reaksiyonu durdurun.

HRP kromojenleri HRP’nin

alt tabakası hidrojen peroksittir. Hidrojen peroksitin bölünmesi, reaksiyon esnasında rengi değiştiren bir hidrojen vericisinin oksitlenmesine bağlanır.

TMB (3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidin)

TMB çözeltisini her oyuğa ilave edin, 15-30 dakika inkübe edin, eşit hacimde durdurma solüsyonu (2 M H2SO4) ekleyin ve 450 nm’de optik yoğunluğu okuyun.

OPD (o-fenilendiamin dihidroklorür)

Son ürün 492 nm’de ölçülür. Zemini tutun ve ışığa duyarlı olduğundan karanlıkta saklayın.

ABTS (2,2′-azino-di- [3-etil-benzotiyazolin-6-sülfonik asit] diamonyum tuzu)

Son ürün yeşildir ve optik yoğunluk 416 nm’de ölçülebilir.

Bazı enzim substratlarının tehlikeli olduğu düşünülürse (potansiyel kanserojenler), el altında tutun ve eldiven kullanın.

Veri analizi

Y ekseni üzerindeki emilim (doğrusal) ile x eksenindeki (log scale) konsantrasyonlu seri dilüsyon verilerinden standart bir eğri hazırlayın. Bu standart eğrisinden numunenin konsantrasyonuna HESAPLAMA  yapın.  İletişim için Tıklayınız: 

ELİSA ÇALIŞMASINDA SORUN MU YAŞIYORSUNUZ?

Zayıf standart eğrisi:

Neden Olan Çözüm
Yanlış standart çözüm Seyreltmelerin doğru yapıldığından emin olun.
Standart yanlış yeniden oluşturulmuş Açmadan önce şişeyi kısaca döndürün; Çözündükten sonra çözülmemiş materyali inceleyin.
Standart bozulmuş Tavsiye edildiği şekilde standart saklama ve taşıma.
Eğri ölçeğe uymuyor Farklı logolar, 5 parametre lojistik eğrisi uyumu gibi farklı terazileri kullanarak çizmeyi deneyin.
Pipetleme hatası Kalibre edilmiş pipetleri ve uygun pipetleme tekniğini kullanın.

 

Neden Olan Çözüm
Kuluçka süresi çok kısa Örnekleri gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin veya üreticinin yönergelerini izleyin.
Tahlil sınırlarının altında mevcut hedef Seyreltme faktörü veya konsantre numuneleri azaltın.
Uyumsuz örnek türü Test edilmemiş numune türlerinde algılama azalabilir veya mevcut olmayabilir. Pozitif bir kontrolü tespit etmek için tahlilin bilinen bir numune ekleyin.
Plakaya adsorbe edilmesiyle engellenen epitopun tanınması Doğrudan veya dolaylı ELISA ile bir peptidin tespitini arttırmak için mikrotiter plakaya kaplamadan önce büyük bir taşıyıcı proteine ​​konjugat peptidi konjuge edin.
Deneme arabelleği uyumluluğu Tahlil tamponunun ilgilenilen hedefle uyumlu olmasını sağlayın (örn. Enzimatik aktivite muhafaza edilir, protein etkileşimleri tutulur).
Yetersiz saptama reaktifi Üretici talimatlarını izleyerek, tespit reaktifinin konsantrasyonunu veya miktarını arttırın.
Örnek yanlış hazırlandı. Uygun örnek hazırlama / seyreltme sağlayın. Numuneler mikrotiter plate assay formatı ile uyumsuz olabilir.
Yetersiz antikor Farklı konsantrasyonlar / seyreltme antikorları deneyin.
Kuluçka sıcaklığı çok düşük İnkübasyonların doğru sıcaklıkta gerçekleştirildiğinden emin olun.Plakayı içeren tüm reaktifler oda sıcaklığında veya devam etmeden önce imalatçı tarafından önerilen şekilde olmalıdır.
Yanlış dalga boyu Dalga boyunu doğrulayın ve plakayı tekrar okuyun.
Plaka yıkamaları çok kuvvetli Otomatik yıkama sisteminde basıncı kontrol edin ve doğru olduğundan emin olun. Elle yıkama yapılırsa, pipetle hafifçe yıkayın.
Pleyt  kurutuldu Test başladıktan sonra kuyuların kurumasına izin vermeyin. Plakayı tüm inkübasyonlar için sızdırmazlık filmi veya bant kullanarak kapatın.
Enzimatik reaksiyonun yavaş renk gelişimi Kullanımdan hemen önce yüzey solüsyonunu hazırlayın. Stok çözeltisinin kullanım süresinin dolmadığından ve kirlenmediğinden emin olun. Daha uzun inkübasyona izin verin.

Büyük değişim katsayısı (CV)

Neden Olan Çözüm
Kuyularda kabarcıklar Plakayı okumadan önce kabarcıkların bulunmadığından emin olun.
Eşit derecede / iyice yıkanmayan kuyular Plaka yıkayıcıdaki tüm bağlantı noktalarının engellenmediğini kontrol edin. Kuyuları tavsiye edildiği gibi yıkayın.
Eksik reaktif karışımı Tüm reaktiflerin iyice karıştırıldığından emin olun.
Tutarsız pipetleme Doğru pipetlemeyi sağlamak için kalibre edilmiş pipetleri ve uygun tekniği kullanın.
Kenar efektleri Plakayı ve tüm reaktiflerin oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
Tutarsız örnek hazırlama veya saklama Tutarlı örnek hazırlama ve optimum numune saklama koşullarının sağlanması (örneğin, donma / çözülme döngülerini en aza indirgeyin).

Yüksek arka plan

Neden Olan Çözüm
Kuyular yetersiz yıkanır Protokol önerileri uyarınca çukurları yıkayın.
Kirlenmiş yıkama tamponu Tatlı su tamponu hazırlayın.
Çok fazla tespit reaktifı Reaktifin uygun şekilde seyreltiğinden emin olun veya önerilen reaktif konsantrasyonunu azaltın.
Blokaj tamponu etkisiz (örn., Saptama reaktifı bloke ediciyi bağlar, kuyular tamamen bloke olmaz) Farklı engelleme reaktifi deneyin ve / veya yıkama tamponu için engelleyici reaktif ekleyin.
Kuluçka / yıkama tamponlarının tuz konsantrasyonu Tuz konsantrasyonlarının artırılması, spesifik olmayan ve / veya zayıf hedef dışı etkileşimleri azaltabilir.
Durdurma çözeltisi ilave edildikten sonra plakayı okumak için çok uzun bekleme Durdurma çözeltisi ilave edildikten hemen sonra plakayı okuyun.
Antikorun spesifik olmayan bağlanması Doğrudan eşlenik algılama antikoru kullanılıyorsa ya da konjuge sekonder kullanılıyorsa sekonder ile aynı olan uygun bloke edici tamponlar, örneğin BSA ya da% 5-10 normal serum türü kullanın. Özgül olmayan eklentiyi önlemek için kuyuların ön işleme tabi tutulmasını sağlayın.
Yüksek antikor konsantrasyonu En iyi sonuçlar için farklı dilüsyonları deneyin.
Işık altında gerçekleştirilen substrat inkübasyonu Yüzey inkubasyonları karanlıkta veya üretici tarafından tavsiye edildiği şekilde yapılmalıdır.
Çökeltiler, substrat ilavesi üzerine oyuklarda oluşmuştur Numunenin seyreltme faktörünü arttırın veya substrat konsantrasyonunu azaltın.
Kirli tabaka Tabla tabanını temizleyin.

Düşük duyarlılık

​​​

Neden Olan Çözüm
ELISA kitinin yanlış depolanması Tüm reaktifleri tavsiye edildiği gibi saklayın. Tüm reaktiflerin aynı depolama gereksinimine sahip olmayabileceğini lütfen unutmayın.
Yeterli hedef yok Numuneyi konsantre hale getirin veya numune seyreltmesini azaltın.
İnaktif algılama reaktifi Muhabir enzim / florürün beklenen etkinliğe sahip olduğundan emin olun.
Plak okuyucu ayarları yanlış Floresan algılama için plaka okuyucunun doğru absorbans dalga boyunu veya uyarma / emisyon dalga boylarını okumaya ayarlandığından emin olun.
Deney biçimi yeterince hassas değil Daha hassas bir algılama sistemine geçin (örneğin, kemilüminesans / floresan için kolorimetrik). Daha duyarlı bir test türüne geçin (örn., ELISA’yı sandviç’e doğrudan ELISA).Kuluçka sürelerini uzatın veya sıcaklığı arttırın.
Hedef mikro titre plakasına kötü adsorbe eder Hedefi mikrotiter plakaya kovalent bağlayın.
Yeterli substrat yok Daha fazla alt katman ekleyin.
Uyumsuz numune türü (örn. Serum vs Hücre özütü Test edilmemiş numune türlerinde algılama azalabilir veya mevcut olmayabilir. Tahlilin pozitif bir kontrol olarak algılandığı bilinen bir örneği ekleyin.
Engelleyici tamponlar veya numune bileşenleri Herhangi bir müdahale eden kimyasalın reaktiflerini kontrol edin.Örneğin antikorlardaki sodyum azid, HRP enzimini inhibe eder ve plazma toplama için antikoagülan olarak kullanılan EDTA, enzimatik reaksiyonları inhibe eder.
Farklı kitlerden gelen reaktiflerin karıştırılması veya yerine konması Bileşenleri farklı kitlerden karıştırmaktan kaçının.

 

Kaynak: wikipedia,Abcam